许多疾病源于人类早期发育。肠道生理学依赖于多种细胞系的综合贡献，这些细胞系的相对丰度和细胞网络从胚胎发育到成年都是波动的。目前，人类细胞图谱(HCA)联盟的研究人员正在绘制人体的每一种细胞类型，以推进对起源于人类早期发育的疾病的理解。
9月8日，《Nature》杂志上发表了标题为“Cellsofthehumanintestinaltractmappedacrossspaceandtime”的研究论文，该研究使用单细胞RNA测序和抗原受体分析，对人类发育中的5个解剖区域和肠道的11个解剖区域的近50万个细胞进行了分析。
人体肠道细胞综合图谱
为了研究整个肠道的细胞动力学，作者在怀孕中期(孕后12-17周)和成人(29-69岁)的不同组织区域进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)，并对肠系膜淋巴结(mLN)进行了引流(图1a)。此外，作者综合了来自妊娠早期(孕后6-11周)小肠、儿科克罗恩病和健康回肠组织的scRNA-seq进行分析。
该数据集包括超过,个高质量单元。Leiden聚类和标记基因分析揭示了上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞、免疫细胞、神经细胞和红系细胞的主要群集(图1b)。胎儿肠道样本中的间充质细胞和神经细胞丰富，从妊娠中期开始，肠道和mLN中免疫细胞的丰度增加(图1b)。从妊娠中期开始，肠道和mLN中的免疫细胞数量增加(图1b)。细胞谱系的进一步亚聚类鉴定了具有特定转录特性的种细胞类型和状态(图2a)。
以前在人类小肠和大肠中观察到的BEST4上皮细胞，在不同的肠区有不同的丰度(图1c，d)。利用差异细胞类型丰度分析，作者确定了它们的区域特异性表达信号(图1e)。值得注意的是，小肠BEST4细胞的标志是CFTR基因的高表达，该基因编码一个氯通道，并在囊性纤维化中发生突变(图1e)；在蛋白质水平也观察到这种高表达。
肠上皮细胞的多样性
在上皮小室中，分泌细胞由杯状、簇状、盘状和微折细胞以及前体细胞组成。吸收细胞和杯状细胞在所有生命阶段都表现出区域分离(图2a，b)。作者还发现编码跨膜丝氨酸蛋白酶2的ACE2和TMPRSS2在发育早期的肠细胞中都有表达，ACE2是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体(图2c)。
肠内分泌细胞(EEC)的亚群分析显示，在妊娠早期胎儿肠道中富含表达NEU-ROG3的前体细胞，和多个成熟的亚群，类似于肠道器官中描述的种群(图2d)。虽然神经肽W(由NPW编码)已知可刺激食物摄入，并由EECs广泛表达，但作者发现了一组表达NPW的肠嗜铬细胞亚群，它们也是PRAC1和RXFP4的特异性细胞。作者描绘了参与NEUROG3前体向肠嗜铬细胞分化的基因，包括最近描述的基因(用箭头标记)，如FEV(图2e)。
值得注意的是，在丛生细胞中最主要的差异表达基因是PLCG2，这是一种典型地与造血细胞相关的磷脂酶。为了探索PLCG2在丛生细胞中的相关性，作者筛选了上游受体的表达(图2F)。FCGR2A在免疫小鼠中被IgG激活并由选定的上皮细胞表达，大约2.75%的丛生细胞特异性表达FCGR2A(图2F)。作者证实了大约5%的小鼠小肠绒毛细胞表达FCGR3蛋白(人FCGR2A的小鼠同源基因)(图2g-j)。受体酪氨酸激酶在绒毛细胞和其他上皮细胞中均有表达。由于已知它们主要与PLCG1激活有关，因此它们是否也与丛生细胞中PLCG2的激活有关还很难描述(图2h)。簇状细胞的PLCG2表达水平高于B系和髓系，并在体内和体外模型中得到证实。下游的信号介质包括RAC2、ITPR2、PRKCA和Trpm5(图2f，h)-表明丛生细胞对免疫细胞信号的应答能力。
肠道神经系统的发育
接下来，作者研究了肠神经嵴细胞(ENCC)的前体细胞的神经细胞分化情况(图3a，b)。ENCC在保持祖细胞储备的同时，平衡了向胶质细胞和神经元的增殖和分化。为了捕捉ENCC分化的离散过程，作者分别分析了早期(孕后6-11周)和晚期(孕后12-17周)的发育。在早期发育中，ENCC主要通过成神经细胞分化为神经元，产生两个不同的分支：分支A(ETV1)和分支B(BNC2)(图3a)，正如在小鼠中观察到的那样。在这个阶段，分支A进一步分化为抑制性运动神经元(IMN，类似于ENC8-ENC)和两个具有内源性初级传入神经元(IPANs)或中间神经元(类似ENC)的亚群，它们与在人胎胃中观察到的细胞相似。分支B进一步分化为未成熟的兴奋性运动神经元(eMN)亚群(分支B1和B2，类似于ENC1-ENC3)(图3a)。
在发育后期，A分支分化为NEUROD6表达的中间神经元(类似于ENC10)，而B分支分化为IPANs(图3b)，与先前描述的成人IPANA细胞相似。作者看到SCGN(分支A1)、GRP(分支A2和A3)和BNC2(分支B1和B2)分别在小孩和成人的肌间神经丛中相反的表达(图3C)。
虽然在孕后6-11周时分化的神经元很丰富，但胶质细胞在发育后期富集。12-17周龄时出现三种类型的肠神经和一个分化胶质细胞亚群(COL20A1)(图3b)。结肠神经胶质1细胞表达后HOX基因和TFAP2B，这表明它们起源于骶骨或躯干。作者在肌间神经丛中观察到了表达BMP8B的细胞，而在肠系膜和肌间神经丛中都发现了表达DHH的细胞(图3d)。
为了鉴定与先天性巨结肠(HSCR)相关的神经细胞，作者筛选了已知的HSCR相关基因的表达。大多数HSCR相关基因在多分化群体中以不同的强度表达(图3e)，并且在神经元A和B分支之间表达不同。例如，RET在A分支神经元中高表达，而在B分支神经元中不高表达。值得注意的是，与同等的小肠亚群相比，ZEB2和EDNRB在结肠胶质细胞和神经母细胞亚群中的表达更高(图3e)。不同区域之间表达的任何差异也可能是由于大肠的发育滞后所致。
次级淋巴器官的形成
肠道相关淋巴组织和mLN是肠道免疫监测的关键部位。作者在孕后12周左右观察到mLN的出现，孕后15时可分辨出其结构。间充质、内皮淋巴组织组织（分别为mLTo和eLTo）与淋巴组织诱导物(LTi)之间的相互作用是启动次级淋巴器官形成的核心。为了更好地理解人类的这一过程，作者评估了涉及的关键细胞类型。
胎儿和成人T细胞和先天淋巴细胞的亚簇显示三个簇与LTi细胞的公开特征相匹配(图4a，b)。这包括高表达的RORC、KIT、TNF、LTA、LTB、IL7R和ITGB7(肠道特异性α4β7整合素的β链)以及生产缺乏的αβTCR。天然淋巴祖细胞(ILCP)在转录上与胎肝ILCP相似，并在胎儿mLN和胚胎肠道中都被发现，而NCR+和NCR3型固有淋巴样细胞(ILC3)在整个孕后6-17周期间跨肠道扩张。这表明LTi样ILC3亚群在肠道相关淋巴组织的发育过程中是扩张的，而不是在mLN的发育过程中。单分子荧光原位杂交(smFISH)染色发现了所有三种LTi样亚型，并将表达CXCR5和RORC的LTi细胞放置在近端肠道粘膜中表达CXCL13的LTo细胞旁边(图4c)，支持这些细胞在发育中的肠道聚集的概念。这些观察结果——再加上编码关键趋化因子基因(CXCR5、CCR7和CCR6)表达和RNA速度分析表明，ILCP是发育的肠道中第一个LTi样细胞，代表ILC3的前体状态。
作者观察了动脉、静脉、毛细血管和淋巴管内皮细胞(LECs)。LEC分为六个簇(标记为LEC1-LEC6)。LEC2细胞表达TNFRSF9、THY1、CXCL5和CCL20，以及NF-κB通路的靶标和粘附分子，包括MADCAM1、VCAM1和SELE，表明它们参与了淋巴细胞的运输。作者证实，高内皮微静脉结构的存在是淋巴细胞进入和PROX1+血管接近CXCL13+mLTo和RORC+LTi细胞所必需的。
在间质间隔内，作者鉴定了肌纤维母细胞亚型、平滑肌细胞亚型、周细胞亚型、卡哈尔间质细胞亚型、间皮细胞亚型和类似于先前在结肠中描述的间质细胞亚型(标记为间质1-4)(图4D)。作者进一步确定了小鼠淋巴结中典型的成纤维细胞群，包括T网状细胞和滤泡树突状细胞。在产前期小肠和mLN中，作者观察到一个间质群体类似于小鼠淋巴结中描述的mLTo。作者进一步确定了控制LEC2、mLTo和LTi样细胞早期白细胞募集的细胞-细胞相互作用，以及胎儿和成人样本之间B细胞激活状态的差异。
为了可视化初始免疫细胞亚群的招募以激活mLTo，作者使用cell2location将单细胞转录组空间映射到孕后17周胎儿回肠中的10xGenomicsVisium空间区域(图4e)。在这项分析中，作者捕获了mLTo标记基因(CCL19、CCL21和CXCL13)表达的组织区域，这些区域可能对应于次级淋巴器官的发育。作者发现，LEC2、mLTo和LTi样亚群映射到与初级免疫亚群相同的组织区。
之后比较了在克罗恩病患者中观察到的淋巴器官生成程序和异位淋巴结构的形成。作者发现，克罗恩病患者组织中的ILC3与胎儿NCR+ILC3匹配的可能性超过60%，而克罗恩病患者的T网状细胞和基质4细胞转在录水平上重组胎儿mLTo。最后，在跨细胞类型的全基因组关联研究中，作者计算了与克罗恩病和溃疡性结肠炎相关的基因的富集分数(错误发现率为10%)。成人ILC3和胎儿ILC3以及NCR+ILC3是富含与克罗恩病相关基因的顶级细胞(图4F)。
总结
通过研究人类肠道的多个区域，在整个发展过程中，童年和成年，创建了一个独特的、详细的健康人类肠道地图。数据集包括对人类肠道多个解剖区域的超过,个单细胞的分析，这些细胞贯穿整个生命周期。肠道细胞图谱揭示了复杂的发育事件，包括肠道中免疫系统和神经系统的发育。作者还研究了克罗恩病患儿肠道活检组织。将其与健康的发育数据结合，为研究罕见和常见的肠道疾病提供了新的见解。在此项研究中，作者确定了三个关键的细胞，它们在发育过程中吸引免疫细胞形成淋巴组织，并表明，同样的发育途径可能导致克罗恩病，为新药物的研究提供了靶位点。
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